分光色度計(jì)原理

分光色度計(jì)的原理是基于分光光度法。分光光度法是通過(guò)測(cè)量樣品溶液對(duì)特定波長(zhǎng)光的吸收程度，來(lái)計(jì)算溶液中某種分子的濃度。而分光色度計(jì)則是在分光光度法的基礎(chǔ)上，加入了顏色的概念，用于測(cè)定物質(zhì)的顏色和色度。

分光光度計(jì)主要由以下幾部分構(gòu)成：

光源：產(chǎn)生單色光，常用的有鎢燈、氬燈、氪燈等。

單色器：將光源分解為多色光的器件。

吸收光譜區(qū)：對(duì)單色光進(jìn)行吸收的區(qū)域。

發(fā)射光譜區(qū)：對(duì)單色光進(jìn)行發(fā)射的區(qū)域。

測(cè)量系統(tǒng)：包括讀數(shù)系統(tǒng)、光電元件和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

分光光度計(jì)在樣品測(cè)量中的工作原理如下：

樣品吸收光譜區(qū)：光源發(fā)出的單色光通過(guò)樣品，樣品中的各種成分吸收不同波長(zhǎng)的光，吸收最強(qiáng)的波長(zhǎng)即為樣品的特征波長(zhǎng)。

發(fā)射光譜區(qū)：經(jīng)過(guò)樣品后，光源中的光被樣品吸收，部分光被反射、散射或透射出去，剩下的光經(jīng)過(guò)樣品后照射到接收器上。

測(cè)量系統(tǒng)：讀取接收器上的光強(qiáng)度，并將其轉(zhuǎn)換為樣品濃度的數(shù)字信息。

分光光度計(jì)具有靈敏度高、準(zhǔn)確度好、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。

分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長(zhǎng)的光源，通過(guò)系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的光源，光線透過(guò)測(cè)試的樣品后，部分光線被吸收，計(jì)算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
　　單色光輻射穿過(guò)被測(cè)物質(zhì)溶液時(shí)，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長(zhǎng)度）成正比，其關(guān)系如下式：
　　A=-lg（I/I。）=-lgT=kLc
　　式中 ：A 為吸光度；
　　I。為入射的單色光強(qiáng)度；
　　I 為透射的單色光強(qiáng)度；
　　T 為物質(zhì)的透射率；
　　k 為摩爾吸收系數(shù)；
　　L 為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長(zhǎng)；
　　c 為物質(zhì)的濃度；
　　物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收波長(zhǎng)，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液，測(cè)定其吸收度，即可由上式計(jì)算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見(jiàn)光區(qū)，除某些物質(zhì)對(duì)光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒(méi)有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過(guò)處理使其顯色后再測(cè)定，故又稱比色分析。由于顯色時(shí)影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測(cè)定時(shí)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吠瑫r(shí)操作。

　　分光光度計(jì)原理是什么

　　在分光光度計(jì)中，將不同波長(zhǎng)的光連續(xù)地照射到一定濃度的樣品溶液時(shí)，便可得到與眾不同波長(zhǎng)相對(duì)應(yīng)的吸收強(qiáng)度。如以波長(zhǎng)（λ）為橫坐標(biāo)，吸收強(qiáng)度（A）為縱坐標(biāo)，就可繪出該物質(zhì)的吸收光譜曲線。利用該曲線進(jìn)行物質(zhì)定性、定量的分析方法，稱為分光光度法，也稱為吸收光譜法。用紫外光源測(cè)定無(wú)色物質(zhì)的方法，稱為紫外分光光度法;用可見(jiàn)光光源測(cè)定有色物質(zhì)的方法，稱為可見(jiàn)光光度法。它們與比色法一樣，都以Beer-Lambert定律為基礎(chǔ)。
　　近年來(lái)，紫外及可見(jiàn)光分光光度分析已得到廣泛的應(yīng)用，它不僅可以用于物質(zhì)的鑒定及結(jié)構(gòu)分析，而且還可以用于某些物質(zhì)含量的測(cè)定。

　　分光光譜技術(shù)可用于：

　　通過(guò)測(cè)定某種物質(zhì)吸收或發(fā)射光譜來(lái)確定該物質(zhì)的組成。
　　通過(guò)測(cè)量適當(dāng)波長(zhǎng)的信號(hào)強(qiáng)度確定某種單獨(dú)存在或與其他物質(zhì)混合存在的一種物質(zhì)的含量。
　　通過(guò)測(cè)量某一種底物消失或產(chǎn)物出現(xiàn)的量同時(shí)間的關(guān)系，追蹤反應(yīng)過(guò)程。
　　一、紫外及可見(jiàn)光分光光度法這是一種只在可見(jiàn)光及紫外光光譜應(yīng)用范圍內(nèi)測(cè)量物質(zhì)吸收輻射線的技術(shù)，應(yīng)用十分廣泛。其中分光光度計(jì)可用于精確測(cè)量特定波長(zhǎng)的吸收值，而比色計(jì)則是一種較簡(jiǎn)單的測(cè)量?jī)x器，其原理是利用慮光片來(lái)測(cè)量較寬波段（如可見(jiàn)光中的綠光、紅光或藍(lán)光范圍）的吸收值。

　　光吸收法則：
　　溶液對(duì)光的吸收有兩個(gè)基本法則：
　　透過(guò)溶液的光的吸收值同吸收溶質(zhì)的分子數(shù)目（即溶質(zhì)濃度［C］）呈指數(shù)相關(guān)。
　　透過(guò)溶液的光的吸收值同透過(guò)吸收溶液的路徑長(zhǎng)度l成指數(shù)相關(guān)。
　　這兩條法則包括在比爾-朗伯關(guān)系式中。通常以入射光（Io）和出射光（I）的光密度來(lái)表示：
　　ε其中ε對(duì)于吸收物質(zhì)及波長(zhǎng)是一個(gè)常數(shù)，稱為吸光系數(shù)或吸收系數(shù)，［C］的單位為mol/L或g/L，l的單位為ml.這一公式非常有用，因?yàn)榇蠖鄶?shù)分光光度計(jì)設(shè)計(jì)為直接測(cè)量log10（Io/I）的值（A）或消光值（E）（舊教材中可能使用以廢除的術(shù)語(yǔ)：光密度）。對(duì)于遵循比爾-朗伯關(guān)系的物質(zhì)，A與C呈線性關(guān)系。吸收值常用下標(biāo)表示其波長(zhǎng)，如A550表示550nm處的吸收值。透過(guò)溶液的光的比例稱為透光率（T），可由出射光和入射光的比值求得。
　　吸收值（A）（absorbance）--由公式得出：
　　透光率（T）（transmittance）--通常以百分?jǐn)?shù)表示：T=（I/Io）×（一）比色計(jì)比色計(jì)用于測(cè)定顏色明顯，并且是溶液主要組分的待測(cè)物，如血液中的血紅細(xì)胞，也可以在待測(cè)物之中加入一種試劑，使其形成有色產(chǎn)物（一種生色團(tuán)），如用茚三酮法測(cè)定氨基酸含量。定量分析某種物質(zhì)要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線是在測(cè)定待測(cè)樣品的同時(shí)測(cè)定已知含量的物質(zhì)來(lái)制成的，而不是使用比爾-朗伯關(guān)系。
　　光源通常為鎢絲燈泡，通過(guò)一個(gè)凸透鏡聚焦后產(chǎn)生一束平行光，平行光穿過(guò)裝有溶液的玻璃樣品或小池，然后透過(guò)一個(gè)有色濾光片到達(dá)光電管檢測(cè)儀，檢測(cè)儀產(chǎn)生一個(gè)同落在光電管上的光密度成正比的電勢(shì)，來(lái)自于光電管的信號(hào)被放大然后傳遞到電流計(jì)或數(shù)字讀數(shù)器。

　　比色計(jì)的使用：

　?、俳油娫词箖x器穩(wěn)定，使用前至少要讓燈預(yù)熱5min;② 選擇一種同底物顏色互補(bǔ)的濾光器;③調(diào)零（用空白對(duì)照調(diào)零）;④調(diào)整靈敏度;⑤分析樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液;⑥由于不同比色杯的吸光特性、杯壁厚度不同，因此為了提高精確度，同一試驗(yàn)應(yīng)用同一比色杯，且在比色槽中擺放的方位相同;⑦每次測(cè)樣前清洗比色杯;⑧經(jīng)常重復(fù)測(cè)定同一溶液檢驗(yàn)比色計(jì)的可重復(fù)性;⑨用標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　由于大多數(shù)過(guò)濾器過(guò)濾出來(lái)的光的波帶很寬，因而比色計(jì)既不能用于確定某種復(fù)合物，也無(wú)法分辨在混合液中吸收特性非常相近的兩種物質(zhì)。比色計(jì)所用光電管的變化系數(shù)為0.5%左右，因而不適合要求具有高度精確性的工作。使用這種最簡(jiǎn)單的儀器，由于儀表上對(duì)數(shù)測(cè)量刻度單位的隨意性，即使是把表上的靈敏度/刻度調(diào)節(jié)到零控點(diǎn)，在一個(gè)儀器上獲得的值不可直接同另一臺(tái)儀器上測(cè)得的值相比較，同一儀器的不同設(shè)置之間也不可直接比較。比色計(jì)對(duì)于特定波長(zhǎng)的量化工作是不合適的。
　?。ǘ┳贤夤?可見(jiàn)光分光光度計(jì)紫外光/可見(jiàn)光分光光度計(jì)基本裝置中采用高強(qiáng)度的鎢燈作為光源，能夠在可見(jiàn)光范圍（400~700nm）調(diào)節(jié)。氘燈用于紫外分光光度測(cè)量（200~400nm）;使用氘燈時(shí)要用石英杯，因?yàn)樽贤饩€不能透過(guò)玻璃。
　　分光光度計(jì)之所以優(yōu)于比色計(jì)就在于使用了一個(gè)衍射光柵將光源的復(fù)色光轉(zhuǎn)換為單色平行光束。實(shí)際上從這種單色一種產(chǎn)生的光不是某個(gè)波長(zhǎng)的光，而是一段窄的帶寬上的光，帶寬是分光光度計(jì)的一個(gè)重要特性，這是由于它決定了吸收測(cè)量中所用的波長(zhǎng)--普通分光光度計(jì)的帶寬為5~10nm，用于研究的儀器的帶寬小于因?yàn)楣鈻艎A縫的寬度影響著帶寬，帶寬隨光柵夾縫的寬度的減少而降低，要獲得特定波長(zhǎng)下的精確數(shù)據(jù)，盡可能使用最小的縫寬度。然而，減少了縫寬也會(huì)減少到達(dá)監(jiān)測(cè)器的光度，降低了信/噪比?？p寬可減少的程度取決于檢測(cè)/放大系統(tǒng)的靈敏度及穩(wěn)定性于離散光的存在。
　　大多數(shù)UV/可見(jiàn)光分光光度計(jì)使用的比色杯的光穿過(guò)路徑為10nm.一次性塑料杯適合于對(duì)水和乙醇溶液在可見(jiàn)光范圍內(nèi)的測(cè)量。玻璃比色杯的生產(chǎn)要求更加嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，因而在精確研究中要使用玻璃比色杯，尤其當(dāng)溶液的吸收值很低時(shí)（《0.1），即使盛對(duì)照液與待測(cè)樣品液的比色杯在光學(xué)性質(zhì)上有稍許不同，也會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏差。玻璃和塑料會(huì)吸收UV光，因此在測(cè)波長(zhǎng)小于300nm的吸收值時(shí)要使用石英杯。
　　進(jìn)行測(cè)量之前，比色杯要保證干凈，無(wú)劃痕，外表面干燥，盛液到適當(dāng)高度，并放在了比色槽中的正確位置。生物樣品中蛋白質(zhì)和核酸可能會(huì)在玻璃/石英杯的內(nèi)表面沉積，因而要用棉球沾上丙酮擦去比色杯內(nèi)的沉淀或用1mol/L硝酸浸泡過(guò)夜。腐蝕性及毒性溶液必須使用有蓋子的比色杯，以防止濺出，破壞儀器。
　　基本分光光度計(jì)使用的光電管類似于比色計(jì)中所使用的光電管。許多情況下，當(dāng)波長(zhǎng)高于和低于550~600nm時(shí)必須使用不同的光電管，這是因?yàn)樗鼈冊(cè)诳梢?jiàn)光波長(zhǎng)內(nèi)的靈敏度不同，更精彩的儀器中所使用的是具有比光電管更高的靈敏度和穩(wěn)定性的檢測(cè)器。數(shù)字顯示由于不易產(chǎn)生視覺(jué)錯(cuò)誤和誤讀范圍的錯(cuò)誤，正逐漸代替指針讀數(shù)。一些儀器可以直接給出所測(cè)定物質(zhì)的濃度。
　　。紫外光/可見(jiàn)光分光光度計(jì)的類型：
　　基本分光光度計(jì)只產(chǎn)生單束光。這種儀器首先用空白對(duì)照調(diào)到零吸收值，然后取出空白液，加入待測(cè)液，測(cè)定待測(cè)液的吸收值。也有一種雙束分光光度計(jì)，有單色光源產(chǎn)生的光束被分為兩束，一束穿過(guò)待測(cè)液，另一束穿過(guò)空白液。吸收值由一個(gè)電子線路通過(guò)對(duì)比透過(guò)待測(cè)液及空白液的出射光進(jìn)行測(cè)定。雙光束分光光度計(jì)減少了由于光源輸出的不穩(wěn)定或檢測(cè)系統(tǒng)靈敏度的變化而導(dǎo)致的測(cè)量錯(cuò)誤，這時(shí)由于待測(cè)液與對(duì)照液是同時(shí)進(jìn)行測(cè)量的。記錄式分光光度計(jì)是一種雙束測(cè)定儀，用于記錄已知波段下吸收值隨時(shí)間的變化（如用于酶分析）。

　　分光光度計(jì)的定量分析：

　　假如已知一種物質(zhì)在某一波長(zhǎng)下的吸光率（通常是該物質(zhì)的最大吸收值，這時(shí)靈敏度最高），這種物質(zhì)純?nèi)芤旱臐舛瓤捎帽葼?朗伯關(guān)系式算出。摩爾吸光系數(shù)是指物質(zhì)在1mol/L的濃度下，比色杯厚度為1cm時(shí)的吸收值。該值可以從光譜數(shù)據(jù)表中查到，也可以用實(shí)驗(yàn)方法通過(guò)測(cè)量一系列已知濃度的物質(zhì)的吸收值來(lái)繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。這樣，在所要求的濃度范圍內(nèi)，便可確定吸收值與濃度之間存在的線性關(guān)系，該直線的斜率即為摩爾吸光系數(shù)。
　　比吸光率是指物質(zhì)質(zhì)量溶液濃度為10g/L時(shí)，比色杯厚度為1cm時(shí)測(cè)定的吸光值。該值對(duì)于未知分子質(zhì)量的物質(zhì)如蛋白質(zhì)核酸的測(cè)定很有用，這種情況下溶液中物質(zhì)的含量以其質(zhì)量表示而不用摩爾濃度表示。使用公式Log10（Io/I）=εl［C］時(shí)，比吸光率要除以10才可以得到一個(gè)以g/L為單位的濃度值。
　　這種簡(jiǎn)單的方法不能用于測(cè)定混合樣品。在這種情況下，也許可以通過(guò)測(cè)量幾個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度來(lái)估算每種成分的含量，如可用此方法在核酸存在下進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的估算.